組織異質性：腫瘤組織由多種細胞類型構成，包括腫瘤細胞、免疫細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞等，且不同細胞間的物理特性和生物學特性差異顯著。同時，腫瘤細胞本身還存在高度的異質性，在基因表達、細胞表面標志物表達以及細胞功能等方面均有不同。這就導致在制備單細胞時，很難找到一種通用的方法來高效且溫和地將所有類型的細胞分離出來，并且保證每種細胞的完整性和活性。

細胞間連接復雜：腫瘤細胞之間以及腫瘤細胞與細胞外基質之間存在著復雜的連接結構，如緊密連接、橋粒、黏著斑等，這些連接使得腫瘤組織具有較高的機械強度。要將腫瘤組織解離成單細胞，就需要破壞這些連接，但常用的解離方法如酶解、機械解離等，在破壞連接的同時，容易對細胞造成損傷，影響細胞的活性和功能。

細胞活性與功能維持：在制備單細胞的過程中，無論是酶解、機械處理還是化學處理，都可能對細胞造成一定的應激和損傷，導致細胞活性下降、細胞內信號通路改變以及細胞功能受損。而對于后續的單細胞分析實驗，如單細胞測序、細胞培養、細胞功能檢測等，都需要細胞保持較高的活性和完整的功能，才能獲得準確可靠的實驗結果。因此，如何在單細胞制備過程中地維持細胞的活性和功能，是一個關鍵的難點。

避免細胞團聚：解離后的單細胞在懸液中容易發生團聚現象，這是由于細胞表面的電荷、蛋白質等物質相互作用，以及細胞之間的黏附力所致。細胞團聚不僅會影響單細胞的計數和分析，還可能導致部分細胞被包裹在團塊中，無法被后續的實驗所檢測到，從而造成細胞信息的丟失。防止細胞團聚需要在解離過程中加入適當的試劑，如蛋白酶抑制劑、抗氧化劑等，同時還需要優化操作流程，盡量減少細胞在懸液中的停留時間。

雜質去除：腫瘤組織中除了細胞成分外，還含有細胞外基質、血液成分、壞死組織等雜質。在單細胞制備過程中，如果這些雜質不能被有效地去除，會對后續的實驗產生干擾。例如，細胞外基質可能會影響細胞的分散和貼壁，血液中的紅細胞會干擾細胞計數和分析，壞死組織中的細胞碎片可能會激活細胞的免疫反應，影響細胞的功能狀態。因此，需要采用合適的方法去除這些雜質，以獲得純凈的單細胞懸液。